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Western Blot归一化:看家蛋白or总蛋白

必发彩票直播网信息网 2020/07/13 14:13:18 点击 113 次

做Western Blot的小伙伴,是不是还在为归一化方法而纠结呢?今天小编就和大家汇总一下看家蛋白和总蛋白归一化的方法。

看家蛋白归一化

使用看家蛋白的最大缺点是在样品间和不同条件下表达水平可能不一致。如使用看家蛋白进行标准化,必须先花费时间和精力来验证内参的选择。

使用看家蛋白的第二个重大挑战是它们的表达丰度很高,如果样品中的看家蛋白表达非常高,这会限制在凝胶上加载的样品量,如果感兴趣的蛋白不是同样的表达丰度,那这两种蛋白质就不在同一线性检测范围内。

如果您正在进行多重蛋白印迹,例如比较同一蛋白质的磷酸化和非磷酸化形式,则需要考虑的第三个挑战是从不同物种中产生一抗和二抗的复杂性。

最后,检测的看家蛋白可能干扰感兴趣蛋白的检测。理想情况下,看家蛋白应该与感兴趣蛋白的大小不同,因此这两种蛋白可在印迹上空间分辨。当实验在同一印迹上检查多种目的蛋白时,这就变得越来越困难。


总蛋白归一化


使用总蛋白归一化,是直接在膜上检测总蛋白,并且该值在归一化时用作分母。总蛋白染色提供更宽的动态范围,并且表现出比看家蛋白更低的可变性和更精准的定量数据。

与使用看家蛋白相比,图像采集后的分析工作流程基本不变; 整个泳道或泳道中大部分信号用于归一化,而不是单一的条带。

例如:JBC、Narute和Proteomics等期刊会推荐使用总蛋白归一化方法。

使用总蛋白染色剂对膜进行染色提供了质控优势,可以验证转印是否完全。


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[来源:CYCLOUD]  
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